HUNGAROVET TUDÁSBÁZIS
www.allatorvosiwikipedia.com

Keresés:

A bélsárkenetek citológiai vizsgálata

A bélsár citológiai (mikroszkópos) vizsgálata során négy kenetet készítünk. Az elsőt a vérkenetekhez hasonlóan panoptikus festési eljárással festjük meg (pl. Diff-Quick). Szudán-vörössel (2. kenet) a bélsár zsír-, Lugol-oldattal pedig (3. kenet) keményítő- tartalmát mutatjuk ki. A negyedik kenetet Gram szerint festjük meg, ezzel a normál baktériumflóra esetleges eltolódását vizsgáljuk. Minden esetben a vizsgálatot először kis nagyítással (200x), majd immerziós objektívvel, nagy nagyítással (1000x) végezzük.

Az elbírálás szempontjai

  1. a baktériumok mennyisége
  2. a baktériumok morfológiai jellegzetességei
  3. gombaspórák vagy –fonalak jelenléte
  4. paraziták jelenléte
  5. emésztetlen táplálékrészek előfordulása (pl. izomrostok, növényi részek)
  6. sejtek megjelenése: vörösvérsejtek, neutrophil vagy eosinophil granulocyták, lymphocyták,bélhámsejtek, malignus alakok
  7. emésztetlen zsír- fehérje- vagy keményítő alkotórész előfordulása 8speciális festésieljárások: Szudán-festés, Lugol-festés)
  8. Gram-festés szerinti eltérés

 

Az alkalmazott festési eljárások menete

Festési eljárás

Diff-Quick festés

  • a 3 oldatból álló készlet festékeinek pontos összetevőjét a gyártók nem ismertetik
  • Egyszerű festési eljárás- a bélsár szerves alkotórészeinek kimutatására·
  • A baktériumok és gombaspórák liláskékre festődnek, a sejtek magja basophil, cytoplasmájuk acidophil.

A festés menete

1. kenet készítés: bélsár szélesztése zsírtalanított tárgylemezen, majd levegőn szárítás

2. alkoholos fixálás (fixáló oldat), szárítás

3. eosinos festés (piros oldat)

4. festék csapvízzel való leöblítése

5. hematoxilines festés (kék oldat)

6. festék csapvízzel való leöblítése

7. szárítás

Szudán-festés

  • Emésztetlen zsír kimutatására·
  • A zsír színe: o Sudan-III: narancsvörös o Sudan-IV: fekete

A festés menete

1. kenet készítés

2. Sudan-III. vagy Sudan-IV oldat rétegzése a tárgylemezre

3. 10-15 perc inkubáció szobahőn

4. a festék csapvízzel való leöblítése

5. szárítás

Lugol-oldatos festés

  • Emésztetlen keményítő kimutatására·
  • Keményítő színe: kékeslila

A festés menete

1. kenet készítés

2. Lugol-oldat rárétegzése a tárgylemezre

3. 10-15 perc inkubáció szobahőn

4. festék csapvízzel való leöblítése

5. szárítás

Gram-festés

  • Gram + és Gram – baktériumok elkülönítésére·
  • A baktériumok arányát %-ban adjuk meg. o Gram + bakériumok: kéko Gram – bakériumok: piros

A festés menete

1. kenet készítés

2. Genciánaibolya-oldat rárétegzése a tárgylemezre

3. 10-15 perc inkubáció szobahőn

4. festék leöntése

5. Lugol-oldat rárétegzése

6. 1-1,5 perc inkubáció szobahőn

7. festék leöntése+kivonása 96%-os abszolút alkohollal

8. csapvízzel való leöblítés

9. kontrasztfestés szafranin-oldattal 1-2 percig10. szárítás

A fiziológiás bélsár összetétele

A bélsár színét elsősorban a bilirubin átalakulási terméke, a stercobilin adja. Az anorganikus anyagokat a rosszul oldódó sók képzik, organikus összetevőit pedig az emésztőnedvek, levált hámsejtek, fehérvérsejtek és a baktériumok alkotják. Utóbbiak között húsevőkben a Gram-negatív pálcák túlsúlya figyelhető meg. Az állatok fiziológiás takarmányozása során a bélsár csak nagyon kis mennyiségben tartalmaz emésztetlen tápanyagokat (pl. magvakat, csontot, növényi rostokat, stb.)

A bél mikroflórájának pontos összetételét sokan tanulmányozták. Egy vizsgálat során egészséges beagle kutyák különböző nyálkahártyáiról vettek mintákat mikrobiológiai vizsgálat céljából. A rectumból származó mintában 20 különféle baktérium- és 10 gombafaj tenyészett ki. A fajok az emberéhez hasonlítottak: Escherichia coli, Streptococcus mitis, Enterococcusok, Streptococcus lactis, Bacillus spp., és egyéb coliformok. Más vizsgálat is alátámasztotta, hogy a húsevők normál bél mikroflórája igen hasonlít az emberéhez: a gyomor magas aciditását csak kevés baktérium él túl, közülük a legjelentősebb, a gastritisek és peptikus fekélyek 95%-áért felelős Helicobacter pylori. (Kutyákban és macskákban is régóta, lassan 20 éve ismerik a gasztrikus Helicobacter spp.-t, de még nem mutatták ki patogén szerepüket). Egyéb, rokon Helicobacter fajokat szintén találtak már az említett fajok epeutaiban és belében. A vékonybél kisszámú Streptococcus, Lactobacillus törzseket, élesztőgombát és Candida albicans-t tartalmaz. A terminális ileumban ugyanezek már nagyobb számban jelennek meg. A vastagbél a baktériumflóra fő helye. Leginkább Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus és Clostridium törzsek alkotják a vastagbélflórát. Egy egészséges ember székletének 20%-a tartalmaz baktériumot.

Eltérések

1. Baktériumok

Festett kenetben a vegyes flóra nagy részét coliformok alkotják, amelyek faji megkülönböztetése morfológia alapján csaknem lehetetlen. Néhány jellegzetes forma felismerhető (Clostridiumok, Campylobacter, Spirochaeta, coccoid alakok), de általában csak a nagyobb számú megjelenésüknek, és a normál flóra egyidejű megfogyatkozásának van kóroktani jelentősége.

A három legfontosabb enteropatogén kórokozó a Salmonella, a Campylobacter és enteropatogén E. coli. Rajtuk kívül még kb. 100-200 fajt ismerünk, ami a normál emésztő traktusban kolonizálódik, jelenleg azonban nagyon kevés ismerettel rendelkezünk ezen egyéb baktériumok szerepéről és esetleges ártalmasságáról. A bélcsatornában megtalálhatók úgynevezett opportunista patogének is, melyek részei a normál flórának kutyában és macskában, de bizonyos hatásokra, mint a hospitalizáció, hirtelen takarmányváltás, enterotoxint termelhetnek. Ilyen például a Clostridium perfringens és a Clostridium difficile. Utóbbi A és B toxint termel és főleg krónikus hasmenésben jellemző az előfordulása. A Clostridium perfringens Diff-Quick szerint festett kenetben jellegzetes alakú és szakaszosan festődik. Ha feltételezhető az előfordulása, mindenképpen szükséges a spórafestés elvégzése. Ennek során a baktériumok belsejében jellegzetesen zöldre festődő, ovális képletek formájában jelennek meg a spórák. Ha látóterenként legalább 3-4 van jelen, enterotoxin termelés gyanúja áll fenn. A Clostridiumok tenyésztése egyébként nehéz, nem gyakorlatias, a rutin labordiagnosztikában ezért nem használjuk.

Ellenben informatív lehet a bélsárkenet morfológiai bírálata:

  1. Ha a kenetben normál mennyiségű flóra mellett sok Clostridiumot látunk, az nagy valószínűséggel Cl. perfringens. Ekkor, tenyésztés helyett spórafestést kell végezni. Ha sok a spóra (3-4 spóra/látótér), akkor a hasmenést toxintermelő törzs okozza.
  2. Ha a kenetben gyér flóra mellett sok Clostridiumot látunk, az valószínűleg Cl. difficile törzs. Ez esetben célszerű Clostridium difficile A+B toxin kimutatást végezni (ELISA-módszer).

Coccoid baktériumok: A coccoidok a normál anaerob bélflóra részei. Enterococcusok, Gr-Bacteroidesek is vehetnek fel ilyen formát. Élettaninak azt tekintjük, ha a coccoidok Gram-szerint pozitívan festődnek. Mivel nem tartoznak az enterogén patogének közé, külön nem tenyésztjük őket, emiatt nincs ellentmondás a citológiai vizsgálat során tapasztalt coccoid elszaporodás és a tenyésztés során tapasztalt normál flóra vizsgálati eredmények között. Ha a festett kenetben coccoid-túlsúlyt tapasztalunk a normál flóra rovására, annak több oka lehet: előzetes antibiotikum adás (pl. enrofloxacin) könnyen kiirthatja a normál flórát, és ilyenkor a coccoidok túlszaporodhatnak (leggyakrabban Enterococcusok). Emiatt a kórelőzmény pontos ismerete elengedhetetlen. Más esetben felmerül az állat immunszupresszált állapota, ami lehetővé teszi az egyébként nem enteropatogénnek számító kórokozók elszaporodását. Ilyen esetekben van szükség általános, véres agaron történő szélesztésre és az ilyen „különleges” kórokozók ezúton történő kimutatására.

Campylobacterek: Vizsgálataink során Campylobacter-fertőzöttség nem fordult elő. Kis számban való megjelenésük nem bír kóroki jelentőséggel. Morfológiájuk alapján könnyen felismerhetők.

Spirochaeta okozta enteritis igazi különlegességnek számít. Ezek a baktériumok is könnyen felismerhetők jellegzetes csavart formájukról. A Campylobacterektől annyiban különböznek, hogy jóval nagyobbak.

2. Gombaspórák vagy –fonalak jelenléte

A gombák nagy biztonsággal felismerhetők a festett kenetekben, faji besorolásuk már nehezebb. Azonban ennek jelentősége csekély, kis mennyiségben a normál mikroflóra alkotói. A mikrobiológiai vizsgálat során külön gombatenyésztés bélsárból nem is történik, azonban a használt táptalajokon ők is kinőnek, jellegzetes telepeik felismerhetők. Mennyiségi elbírálásuk meglehetősen szubjektív. Mivel nem tenyésztjük őket, csak mikroszkópikus szinten bíráljuk el jelenlétüket, mennyiségüket. Vagyis ebben az esetben a citológiai vizsgálatnak különleges szerepe van. Ha nagy mennyiségben vannak jelen a spórák, az többnyire másodlagosnak tekinthető: általában antibiotikum-túletetés következménye. (Vagyis nem a gombák felelősek a dysbacteriosis létrejöttéért, hanem inkább mint következmény jelennek meg.)

3. Paraziták jelenléte

Paraziták kimutatásához festett kenetben nagy szerencse is kell, hiszen minimális jelenlét esetén nem biztos, hogy felkerülnek a tárgylemezre. Nem véletlen, hogy a paraziták kimutatására pl. felszíndúsítást vesznek igénybe. Emiatt kimondhatjuk, hogy parazitózis megállapítására a bélsár citológiai vizsgálat nem alkalmas.

4. Emésztetlen táplálékrészek előfordulása (pl. izomrostok, növényi részek)

Jellegéből adódóan a mikrobiológiai vizsgálat nem tudja cáfolni vagy megerősíteni a rostemésztési zavart.

5. Sejtek megjelenése

A sejttartalom megítélésében a mikrobiológiai vizsgálatnak szintén nincs jelentősége. A Diff-Quick szerint festett kenet messzemenően alkalmas a különböző sejtalakok kimutatására.

6. Emésztetlen zsír- fehérje- vagy keményítő alkotórész előfordulása

Ezen alkotók kimutatása tipikusan a citológiai vizsgálatok körébe tartozik, és egyben megfelelő módszernek is tekinthető. A nagyobb mennyiségű fehérje megjelenése nem feltétlenül a fehérje vesztés jele, a bélsár megnőtt nyálka (mucin)-tartalmára is utalhat. A keményítő- és zsírpozitivitás e két anyag nem megfelelő lebontásának következménye, szintén nem tartozik a mikrobiológia tárgykörébe.

7. Gram-festés szerinti eltérés

A citológiai vizsgálat során alkalmazott Gram-festés elbírálása nagyon szubjektív és sok tényező befolyásolja (a festés menetének pontos betartása, legfőképp az alkoholos kivonás). A tapasztalt flóra-eltolódás valamelyik irányba (Gram-pozitív vagy negatív túlsúly) nem biztos, hogy igazi dysbacteriosist jelöl. A dysbacteriosis kimondása az egyik legnehezebb feladat, és mikrobiológiai vizsgálat nélkül nem lehetséges (éppúgy, ahogy önmagában a tenyésztés eredménye sem elegendő a megállapítására. Vagyis a két vizsgálati metódus erősen egymásra van utalva).

 Összeállította: Halmay Dóra: Az összeállításhoz Dömötör Éva szakdolgozatosom munkáját használtam fel: A társállatok bélsarának citológiai és mikrobiológiai vizsgálata (Szakdolgozat, 2008)

Kategóriák: Diagnosztikai tesztek

Kapcsolódó irások: